Студопедия — Простые и сложные методы окраски

Методы окраски

ОКРАСКА МИКРООРГАНИЗМОВ — комплекс методов и приемов, применяемый для изучения морфологических свойств микроорганизмов. В нативном (естественном) состоянии бактерии имеют такой же коэффициент преломления, как и стекло, поэтому они невидимы под микроскопом. Благодаря О. м. можно изучать их морфол. особенности, что необходимо при проведении бактериологического исследования. Окрашивание бактерий производится как для обнаружения их в исследуемом материале при бактериоскопической диагностике, так и для их идентификации после выделения чистой культуры из исследуемого материала при бактериол. исследовании.

Приготовление окрашенного препарата состоит из следующих этапов: приготовление мазка, его высушивание, фиксация и окраска. Для приготовления мазка на середину чистого предметного стекла наносят небольшую каплю воды и с помощью бактериальной петли помещают в нее исследуемый материал. Материал равномерно распределяют на стекле таким образом, чтобы образовался тонкий мазок круглой или овальной формы размером 1-2 см2. Затем препарат высушивают либо при комнатной температуре на воздухе, либо в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки. Высушенный мазок подвергают фиксации, вследствие чего он прикрепляется к стеклу (фиксируется), микробы инактивируются и становятся безопасными, возрастает их восприимчивость к окраске. Применяют различные способы фиксации. Наиболее простым и самым распространенным способом является фиксация жаром — нагреванием на пламени горелки (препарат несколько раз проводят через наиболее горячую часть пламени горелки). В нек-рых случаях прибегают к фиксации препарата этиловым или метиловым спиртом, ацетоном, смесью равных объемов этилового спирта и эфира (по Никифорову). После фиксации производят окраску мазка. Наиболее пригодными для окраски микробов являются основные и нейтральные анилиновые красители. Окрашенный препарат промывают водой и высушивают. На высушенный мазок наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют, пользуясь иммерсионной системой микроскопа.

Существуют простые и сложные способы окрашивания микробов. При простой окраске, к-рая позволяет быстро изучить морфол. особенности микробов, обычно используют только один краситель, чаще всего красного цвета — фуксин (окраска производится в течение 1-2 мин) или синего цвета — метиленовый синий (время обработки мазка краской 3-5 мин). При сложных методах окраски применяют два или более контрастных красителя, протравы, дифференцирующие вещества и др. Среди сложных методов окраски различают дифференциальные методы и методы, предназначенные для выявления отдельных структур клетки. К дифференциальным методам относятся методы Грама и Циля-Нельсена, позволяющие различать по цвету микроорганизмы, сходные по морфол. свойствам.

Метод окраски по Граму — наиболее распространенный сложный способ окраски. Бактерии в зависимости от того, подвергаются они окраске по этому методу или нет, разделяют на две группы: грамположительные (красящиеся по Граму) и грамотрицательные (не красящиеся) Различие в окраске обусловлено разным строением клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Методика окраски по Граму заключается в последовательной обработке фиксированного мазка: окраске генцианвиолетом через фильтровальную бумагу (1-2 мин), обработке р-ром Люголя (1 мин), обесцвечивании спиртом (1/2-1 мин — до отхождения фиолетовых струек краски), промывании водой, окрашивании фуксином (1-2 мин). Сущность метода состоит в том, что грамположительные бактерии удерживают комплекс краситель — йод и не обесцвечиваются спиртом, грамотрицательные не обладают этим свойством, т. е. обесцвечиваются спиртом (дифференцирующим веществом) и докрашиваются фуксином. В результате грамположительные бактерии приобретают фиолетовый цвет, грамотрицательные — красный.

Метод Циля-Нельсена предназначен для дифференциации кислотоустойчивых бактерий (возбудителей туберкулеза и лепры) от некислотоустойчивых. При окраске по этому методу используют карболовый фуксин Циля, серную к-ту (дифференцирующее вещество) и метиленовый синий. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет карболовым фуксином Циля и не обесцвечиваются к-той, некислотоустойчивые теряют красную окраску при обработке к-той и докрашиваются метиленовым синим.

При изучении структуры микробной клетки используют целый ряд сложных методов. Так, для выявления капсулы у бактерий применяют метод Гинса, для обнаружения спор бактерий — метод Ауески, зерна волютина можно окрасить с помощью метода Нейссера. Для выявления жгутиков используют методы «сверхокраски», при к-рых клетки и отдельные их структуры увеличиваются в размерах и становятся видимыми под световым микроскопом. К методам «сверхокраски» относится, в частности, метод серебрения по Морозову. Он также может быть использован для окрашивания спирохет и даже наиболее крупных вирусов — вирусов оспы.

Читайте также:  Через сколько можно беременеть после кесарева сечения (КС) Ответ на Mamsy

Универсальным методом О. м. является окраска по Романовскому-Гимзе (смесью азура, эозина и метиленового синего). При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра — красно-фиолетовый. Этот метод используют также при исследовании риккетсий, хламидий, спирохет, форменных элементов крови.

7. Простые и сложные методы окраски

Простой метод окраски. Является одноэтапным и заключается в окраске микропрепарата одним красителем. Используют основные анилиновые красители, такие как, фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий в виде водных растворов или пропитанных красителем фильтровальных бумажек, которые помещают на мазок и смачивают водой. Продолжительность окраски составляет 3-5 минут, после чего микропрепарат промывают водой, высушивают и микроскопируют. В препаратах, окрашенных простым методом, можно получить представление о форме, расположении и размерах микробных клеток.

Сложные методы окраски. Сложные (дифференцирующие) методы окраски (по Граму, Цилю-Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и дополнительных способов обработки препаратов. Эти методы позволяют дифференцировать бактерии в зависимости от строения их структур, чаще всего поверхностных. Например, метод окраски по Граму позволяет дифференцировать бактерии по строению их клеточной стенки: грамположительные (фиолетовые) с толстой и грамотрицательные (красные) бактерии с тонкой клеточной стенкой.

Существуют специальные сложные методы окраски, которые используют для выявления структурных компонентов бактериальной клетки: капсул, цитоплазматических включений, спор, жгутиков.

8. Механизмы окрасок по Граму и Цилю-Нильсену

Метод Грама. Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать грамположительные и грамотрицательные бактерии, что является важным таксономическим признаком. Результат окраски определяется особенностями строения клеточной стенки бактерий. При окраске генцианвиолетом и последующем воздействии раствора Люголя образуется комплексное соединение генцианвиолета и йода с пептидогликаном, которое при дифференциации спиртом удерживается в клетках грамположительных бактерий, имеющий многослойный пептидогликан и вымывается из грамотрицательных бактерий, имеющих тонкий слой пептидогликана. При дополнительной окраске водным раствором фуксина грамотрицательные бактерии приобретают красный цвет.

Таблица 4. Метод Грама

На фиксированный мазок поместить фильтровальную бумажку, пропитанную генцианвиолетом, смочить водой, 2-3 минуты

Все бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет

Снять бумажку, слить с препарата оставшуюся краску и налить раствор Люголя на 1 минуту

Все бактерии остаются фиолетовыми

Для дифференцирования нанести на мазок этиловый спирт и обесцветить в течение 30-60 с, промыть водой

Грамположительные бактерии остаются фиолетовыми, грамотрицательные обесцвечиваются

Нанести фуксин Пффейфера (водный раствор фуксина) и докрасить 1-2 мин, промыть водой, высушить

Грамположительные остаются фиолетовыми, грамотрицательные окрашиваются в красный цвет

Метод Циля-Нильсена. Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать кислотоустойчивые и некислотоустойчивые бактерии.

Таблица 5. Метод Циля-Нильсена

На фиксированный мазок нанести карболовый раствор фуксина Циля через полоску фильтровальной бумаги и подогреть препарат в пламени горелки до появления паров (повторить 3-4 раза)

Все бактерии окрашиваются в красный цвет

Снять бумагу, промыть мазок водой

Все бактерии остаются красными

Для дифференцирования нанести 5% раствор серной кислоты на 1-2 минуты

Кислотоустойчивые бактерии остаются красными, некислотоустойчивые обесцвечиваются

Нанести водный раствор метиленового синего и докрасить 3-5 мин, промыть водой, высушить

Кислотоустойчивые остаются красными, некислотоустойчивые окрашиваются в синий цвет

Кислотоустойчивые бактерии имеют особое строение клеточной стенки, содержащей большое количество сложных липидов (миколовых кислот, восков, глико- и фосфолипидов), что делает эти бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивыми. Клеточная стенка этих бактерий плохо воспринимает анилиновые красители и обычные способы окраски. Высокая температура в процессе окраски методом Циля-Нильсена расплавляет липиды, фенол разрыхляет клеточную стенку и краситель проникает внутрь клетки. После остывания препарата липиды вновь затвердевают, прочно удерживая краситель, поэтому кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются серной кислотой и остаются красными. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и их докрашивают контрастным красителем – метиленовым синим. В основном, метод используется для окраски бактерий, относящихся к роду Mycobacterium (M.leprae, M.tuberculosis, M,bovis и др.)

Простые и сложные методы окраски

Выделяют простые и сложные методы окраски.

Простыми методами окрашивания называют окрашивание препаратов каким-либо одним красителем. Некоторые микроорганизмы (спирохеты), плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, легко выявляются при окрашивании негативными красителями.

Читайте также:  Вирус Коксаки – симптомы, лечение, профилактика, признаки у взрослых

Техника приготовления препарата заключается в следующем. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки (мостик), которые лежат над кюветой. На мазок наносят с помощью капельницы 1 % водный раствор фуксина или метиленового синего на 1–2 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания раствор красителя не подсыхал. После завершения окрашивания, краситель сливают. Препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая воде не станет бесцветной. Затем препарат высушивают. Для этого нижнюю сторону препарата промокают фильтровальной бумагой, а верхнюю сторону осторожно обсушивают с боков, не дотрагиваясь до мазка. Препарат окончательно досушивают на воздухе или высоко над пламенем спиртовки. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильтровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки. Микроскопируют препараты с иммерсионной системой.

Присложных (дифференцирующих) методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие – дополнительными. Кроме красителей используются различные обесцвечивающие вещества: спирты, кислоты, ацетон и др. С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов (клеточные структуры, включения и т. д.).

Окраска по методу Грамаявляется самым универсальным из сложных методов окраски. Окраска положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и йода либо терять его после обработки спиртом. Соответственно выделяют грамположительные (Bacillus, Clostridium, Streptococcus, Lactobacillus, etc.) и грамотрицательные (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, etc.) формы.

Для получения достоверных результатов необходимо готовить мазки для окраски по Граму из молодых, активно растущих (обычно односуточных) культур, так как клетки из старых культур иногда дают неустойчивую реакцию по Граму. Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, если бактериальная пленка (мазок) слишком толста и обесцвечивание спиртом не проведено до конца. Грамположительные бактерии могут выглядеть как грамотрицательные, если мазок переобесцвечен спиртом.

Сущность метода. На поверхности цитоплазмы клетки у грамположительных микроорганизмов располагается комплекс из белка и рибонуклеата магния, отсутствующий у грамотрицательных бактерий. При окрашивании по Граму на поверхности грамположительных клеток образуется прочный комплекс из белка, рибонуклеата магния, генцианвиолета и йода, не разрушающийся при обработке спиртом. Такие бактерии остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии не обладают свойством удерживать краску и при обработке спиртом обесцвечиваются. Для выявления их препарат докрашивают фуксином. При этом грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

Этапы дифференцированного окрашивания по Граму:

1 Фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги (1,5 х 1,5 см) и на него до полного смачивания наносят карболовый раствор генцианового фиолетового или кристаллический фиолетовый (чаще используют модификацию Синева). Окрашивание проводят на протяжении 1–2 мин.

2 Бумажку снимают, краситель сливают и, не промывая препарат водой, наносят на препарат раствор Люголя на 1–2 мин до почернения мазка.

3 Сливают раствор Люголя, окрашенный мазок обесцвечивают 96º этиловым спиртом. Для этого препарат 2–3 раза помещают в стакан со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек (время обесцвечивания – не более 30 с), либо наливают 2–4 капли спирта на мазок на 30–45 с.

4 Препарат быстро промывают водой (как описано выше).

5 Мазок дополнительно окрашивают на протяжении 1–2 мин водным раствором фуксина (фуксин Пфейффера).

6 Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой.

7 Микроскопируют с иммерсионной системой.

Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в розовый.

Нуклеоид. Обнаружить нуклеоид в бактериальной клетке при помощи светового микроскопа трудно. Для избирательного окрашивания нуклеоида фиксированные клетки предварительно обрабатывают рибонуклеазой или разбавленной соляной кислотой, чтобы разрушить рибосомальную РНК. Последующее окрашивание основным красителем позволяет выявить нуклеоид в виде плотных тел с неправильными очертаниями, расположенные в центре или на полюсах клетки.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена отражает особенности микобактерий и нокардий.

Принцип метода. Кислотоустойчивость этих бактерий связана с высоким содержанием липидов в клеточной стенке. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются карболовым фуксином Циля при нагревании препарата в красный цвет и сохраняют эту окраску после обесцвечивания серной кислотой. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются кислотой и в последующем докрашиваются метиленовым синим в синий цвет.

Читайте также:  Национальный календарь обязательных профилактических прививок для детей - Топотушки

Для выявления капсул пользуются различными методами, среди которых можно отметить метод Бурри и Бурри-Гинса. В основе метода лежит негативное контрастирование. Так как капсула или тело микробной клетки не воспринимает красители, тушью окрашивается лишь фон микропрепарата. Капсула видна как неокрашенная зона на темном фоне тушевого мазка. По методу Бурри-Гинса тела микробных клеток дополнительно окрашиваются в красный цвет фуксином.

Для окрашивания жгутиков предложено несколько методов, общим этапом для которых является протравливание препарата (обычно растворами таннина, KAl(SO4)2, HgCl2) и последующая окраска (чаще карболовым раствором фуксина). В результате этого на жгутиках происходит осаждение красителя, благодаря чему одновременно достигается как увеличение их толщины, так и уменьшение прозрачности. Одним из предложенных методов окрашивания жгутиков является метод Лейфзона. Препарат микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки бактерий окрашиваются в красный цвет, жгутики принимают вид толстых нитей, отходящих от клетки.

Вопросы для самоконтроля

1 Перечислите основные морфологические типы клеток микроорганизмов.

2 Охарактеризуйте схематичное строение бактериальной клетки.

3 Перечислите этапы приготовления фиксированных препаратов микроорганизмов, охарактеризуйте их.

5 Классифицируйте используемые в микробиологии красители, охарактеризуйте их.

Практическое занятие 3

Цель:ознакомление сметодикой приготовления фиксированных препаратов, простыми и сложными методами окраски; ознакомление с морфологией и цитологией различных микроорганизмов.

Материалы и оборудование: микроскопы биологические, предметные и покровные стекла, спиртовки, бактериальные петли, иммерсионное масло, стерильные пипетки, пинцеты, фильтровальная бумага, спички, палочки ватные гигиенические, маркеры, стерильные чашки Петри, на группу – в 50 мл колбе стерильная водопроводная вода, дистиллированная вода для промывки, промывалки, кюветы, мостики, набор готовых растворов красок в штативе, спирт 96 0 , пипетки, настои из естественных материалов: мяса, гороха и т.д.

Ход работы

1 Рассмотреть разнообразие форм прокариот на рисунке 3.2. Описать морфологию всех представленных форм согласно схеме таблицы 4.1. Оформить таблицу в тетради.

Рисунок 3.2 – Разнообразие форм прокариот

Таблица 3.1 – Морфология клеток микроорганизмов

№ п/п Рисунок микроорганизма Форма клетки, сочетание

2 Рассмотреть рисунок 4.1. Определить указанные под номерами структуры бактериальной клетки. Зарисовать схему в рабочей тетради, сделать соответствующие записи названий.

3 Ознакомиться с этапами и техникой приготовления фиксированных препаратов микроорганизмов.

4 Составить схему простого метода окрашивания.

5 Составить схему окрашивания препаратов по методу Грама.

6 Приготовить фиксированный препарат с использованием простых методов окраски.

7 Приготовить фиксированный препарат по методу Грама.

8 Препараты микроскопировать с объективами 10х и 100х.

9 Охарактеризовать особенности морфологии клеток микроорганизмов согласно схеме таблицы 3.2, записать в рабочую тетрадь. Выполнить рисунки, под рисунком указать увеличение микроскопа.

Таблица 3.2 – Некоторые особенности морфологии клеток

Параметры Характеристика
Состав среды, объект исследования
Возраст культуры
Форма клеток
Сочетание клеток
Окраска по Граму
Рисунок клеток
Выводы:

10 Указать в выводах наблюдаемое разнообразие прокариот; преимущества использования в работе фиксированных препаратов.

1 Борисов, Л. Б. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии / Л. Б. Борисов [и др.]. – М.: Медицина, 1984. – 256 с.

Выделение и идентификация микроорганизмов; учебно-методическое пособие / Р. А. Желдакова. – Мн.: БГУ, 2003. – 36 с.

3 Микробиология: методические рекомендации к лабораторным занятиям и контроль самостоятельной работы студентов / В. В. Лысак, Р. А. Желдакова. – Мн.: БГУ, 2002. – 100 с.

4 Павлович, С.А. Микробиология с вирусологией и иммунологией / С.А. Павлович. – Мн.: Вышэйшая школа. 2008. – 799 с.

5 Практикум по микробиологии /А. И. Нетрусов [и др.]. – М.: Академия, 2005. – 604 с.

6 Теппер, Е. З. Практикум по микробиологии / Е. З. Теппер [и др.]. – М.: Колос, 1979. – 216 с.

Учебное издание

КОНЦЕВАЯ Ирина Ильинична

МИКРОБИОЛОГИЯ:

Практическое руководство

по изучению раздела «Морфология и структурная

организация бактериальной клетки»

для студентов специальности 1–31 01 01-02

«Биология (научно-педагогическая деятельность)»

Подписано в печать . Формат 64х80 1/16.

Бумага офсетная. Ризография. Усл.-печ.л.

Уч.-изд.л. Тираж экз. Заказ №

Издатель и полиграфическое исполнение:

«Гомельский государственный университет

имени Франциска Скорины»

ул. Советская, 104, 246019, г. Гомель

Последнее изменение этой страницы: 2016-09-19; Нарушение авторского права страницы

Ссылка на основную публикацию
Стресс — это психология виды, причины, симптомы, лечение
Хронический стресс: как его преодолеть и почему не стоит закрывать глаза на симптомы состояния Хронический стресс может привести к неврозам,...
Стволовые клетки пуповинной крови
Гистероскопия и выскабливание Выскабливание (чистка)Большинство женщин в своей жизни сталкиваются с ситуацией, когда гинеколог после обследования назначает выскабливание. Часто эту...
Стволовые клетки человека превратили в предшественники яйцеклеток
Половые клетки - мужские и женские Любой взрослый человек прекрасно знает, что новая жизнь зарождается после встречи мужской и женской...
Стресс, мигрень и язва желудка как хроническое напряжение приводит к развитию психосоматических забо
Психосоматика мигрени у женщин Недавно мы говорили о головной боли напряжения. Сегодня расскажу, почему появляется психосоматика мигрени у женщин на...
Adblock detector